雪域迷城-核酸抽提mRNA的分离技巧

与rRNA和tRNA不同的是,哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾,因此可以用oligo(dT)-纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等,1971;AtLeder,1972)。在构建cDNA文库时,必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。

进行Northern杂交或Sl核酸酶作用图分析时,与总RNA相比,采用poly(A)+RNA能获得更为满意的结果。可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)-纤维素,也可以买现成的产品。

1)用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0g0ligo(dT)-纤维素。

2)将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中,雪域迷城体积为0.5-1.0ml,用3倍雪域迷城体积灭菌水冲洗雪域迷城。雪域迷城体积为1m的oligo(dT)-纤维素最大量为10mg总RNA,如果总RNA的量较少,则应减少oligo(dT)-纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。

3)用无菌的1x层析柱加样雪域迷城冲洗雪域迷城直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样雪域迷城

20mmol/LTris.Cl(pH7.6)

0.5mol/LNaCl

1mmol/LEDTA(pH8.0)

0.1%SDS

可按以下方法制备灭菌的层析柱加样雪域迷城;将适量无RNA酶的Tris.Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌,待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10%SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl然后用DEPC处理柠檬钠-NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。

4)用灭菌水溶解RNA,于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温,加等体积的2x层析柱加样雪域迷城,上样,立即用灭菌的试管收集洗液。当所的RNA溶液均进入雪域迷城后,加1倍体积的1x层析柱加样,继续收集洗出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。

5)当全部溶液流出后,将收集液置于65℃温育5分钟,重新上样,并收集流出液。

6)用5-10倍雪域迷城体积的1x层析柱加样雪域迷城洗柱,分部收集洗出液,测定每一收集管的OD260。最补由于不带poly)A)的RNA洗过雪域迷城,OD260会很高,后来OD260值则很小或为零。在某些方案中,上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/LNaCl的1x层析柱加样雪域迷城洗雪域迷城,然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有,因此这一步骤可以省略。

7)用2-3倍雪域迷城体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱雪域迷城洗脱mRNA,以1/3-1/2雪域迷城体积分部收集洗脱液。洗脱雪域迷城

10mmol/LTris.Cl(pH7.6)

1mmol/LEDTA(pH8.0)

0.05%SDS

用于配制洗脱雪域迷城的Tris.Cl和EDTA贮存液应为新近高压的溶液可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱雪域迷城。洗脱雪域迷城不能高压处理,因高压会使溶产生大量气泡。

8)收集液置于透明的小溶器内,测定OD260,使用前比色杯须用浓盐酸:甲醇(1:1)浸泡1小时,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮oligo(dT)-纤维素亲和量层析后得到的RNA中,带与不带poly(A)的RNA,其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA,可将洗脱液于65℃温育3分钟,迅速冷却至室温,加入NaCl至终浓度为0.5mol/L,用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。

9)收集oligo(dT)-纤维素柱层析的洗脱液,在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5倍体积用冰预冷的乙醇,混匀,冰浴至少30分钟。

10)于4℃以g离心15分钟回收poly(A)+RNA,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀(通常看不见沉淀),离心片刻,在空气中晾干核酸沉淀。

11)用少量水重溶RNA,置于比色杯内,测定OD260,使用前比色杯须用浓盐酸:甲醇(1:1)浸泡1小时,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗。

12)将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内,加3倍体积乙醇,混匀,于-70℃保存备用。回收RNA时,只需取出一小份贮存液,加3mol/K乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L,混匀,用微量离心机于4℃以g离心5分钟即可。

i.OD260=1的溶液其RNA含量约为40μg/ml.

ii.从107个哺乳动物培养细胞中可获得1-5μgmRNA,所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1-2%。